Использование и меры предосторожности при использовании ультрафильтрационной центрифужной пробирки
1) Выберите подходящую пробирку для ультрафильтрации.Обратите внимание, что УФ-мембраны различаются по уровню толерантности к различным химическим веществам.Обычно пробирки для ультрафильтрации с порогом молекулярной массы 10 кДа могут выбираться с порогом молекулярной массы, который не должен превышать 1/3 молекулярной массы интересующего белка, например 35 кДа.Если молекулярная масса интересующего белка составляет около 10 кД, можно использовать пробирку для ультрафильтрации с порогом молекулярной массы 3 кД.
(2) Ультрафильтрация, только что купленная, сухая, с добавлением сверхчистой воды перед использованием и водой, полностью пропущенной через мембрану, ледяную баню или холодильник, предварительно охлажденной в течение нескольких минут.Затем сливают воду, то есть белковую жидкость, и сколько ее добавляют, в зависимости от того, какое количество не превышает белой линии в верхней части пробирки.Операция легкая, и перед добавлением белкового раствора пробирку для ультрафильтрации необходимо предварительно охладить на льду.
3) И масса, и центр тяжести должны были достичь баланса.Обратите внимание, что скорость вращения и ускорение не очень высокие, в противном случае ультрафильтрационная мембрана будет напрямую повреждена.Начинали центробежную ультрафильтрацию (предварительно охлажденная до 4 градусов центрифуга).После того, как скорость вращения разных центрифуг была переведена в g, она стала другой.Ускорение центрифуги доводили до минимума, снижая давление на мембрану.Обратите внимание: обязательно покиньте центрифугу после того, как центрифуга достигнет целевой скорости, иначе, если у вас возникнет проблема, вы не сможете справиться с ней в первый раз.Ориентацию мембраны относительно шпинделя регулировали согласно инструкции (корпус угловой центрифуги расположен перпендикулярно мембране оси).При практическом использовании общая скорость вращения ниже указанной в инструкции, что позволяет продлить срок службы центрифужной пробирки.
3) И масса, и центр тяжести должны были достичь баланса.Обратите внимание, что скорость вращения и ускорение не очень высокие, в противном случае ультрафильтрационная мембрана будет напрямую повреждена.Начинали центробежную ультрафильтрацию (предварительно охлажденная до 4 градусов центрифуга).После того, как скорость вращения разных центрифуг была переведена в g, она стала другой.Ускорение центрифуги доводили до минимума, снижая давление на мембрану.Обратите внимание: обязательно покиньте центрифугу после того, как центрифуга достигнет целевой скорости, иначе, если у вас возникнет проблема, вы не сможете справиться с ней в первый раз.Ориентацию мембраны относительно шпинделя регулировали согласно инструкции (корпус угловой центрифуги расположен перпендикулярно мембране оси).При практическом использовании общая скорость вращения ниже указанной в инструкции, что позволяет продлить срок службы центрифужной пробирки.
(4) После концентрации до оставшегося 1 мл возьмите 50 мкл буферного раствора, добавьте 10 мкл проточного раствора и посмотрите, есть ли какой-либо синий цвет, чтобы определить, отсутствует ли в пробирке для ультрафильтрации белок.Если пробирка негерметична, перелейте верхний слой и пропустите жидкость в новую пробирку, чтобы начать ультрафильтрацию.Чтобы точно определить, были ли пропущены пробирки, центрифугируйте в течение 10 минут с 5 мг БСА перед проточным анализом, используя белковый клей или неочищенный анализ по Брэдфорду, и продолжайте, добавляя оставшийся концентрированный белковый раствор (который действует на льду и предотвращает нагревание белков) до тех пор, пока весь концентрат добавлен.Будьте осторожны во время центрифугирования, если происходит осаждение белков, приводящее к закрытию пробирки.Если происходит осаждение, определите, является ли конкретной причиной осаждения чрезмерная концентрация белка или неподходящий буфер;Первое можно решить путем одновременной ультрафильтрации в нескольких пробирках для ультрафильтрации, снижая концентрацию, а второе - путем замены различных буферных растворов до тех пор, пока не перестанет препадать осаждение белка.
(4) После концентрации до оставшегося 1 мл возьмите 50 мкл буферного раствора, добавьте 10 мкл проточного раствора и посмотрите, есть ли какой-либо синий цвет, чтобы определить, отсутствует ли в пробирке для ультрафильтрации белок.Если пробирка негерметична, перелейте верхний слой и пропустите жидкость в новую пробирку, чтобы начать ультрафильтрацию.Чтобы точно определить, были ли пропущены пробирки, центрифугируйте в течение 10 минут с 5 мг БСА перед проточным анализом, используя белковый клей или неочищенный анализ по Брэдфорду, и продолжайте, добавляя оставшийся концентрированный белковый раствор (который действует на льду и предотвращает нагревание белков) до тех пор, пока весь концентрат добавлен.Будьте осторожны во время центрифугирования, если происходит осаждение белков, приводящее к закрытию пробирки.Если происходит осаждение, определите, является ли конкретной причиной осаждения чрезмерная концентрация белка или неподходящий буфер;Первое можно решить путем одновременной ультрафильтрации в нескольких пробирках для ультрафильтрации, снижая концентрацию, а второе - путем замены различных буферных растворов до тех пор, пока не перестанет препадать осаждение белка.
(5) Первые несколько шагов используются для концентрации белка, и если буфер необходимо заменить, осторожно добавьте новый буфер (ультрафильтрация через ультрафильтрационную мембрану 0,22 мкм) примерно до 1 мл общего белка и повторно концентрируйте примерно до 1 мл в течение трех несколько раз подряд, при этом конечный концентрированный объем зависит от желаемой концентрации белка, обычно не более 500 мкл, но также и в пределах 200 мкл.Достигните 1000-кратного или более увеличения в трех случаях, по существу, такого же изменения буфера, которое рассчитано как минимум в 10-кратном или около того объемном обогащении каждый раз.
(5) Первые несколько шагов используются для концентрации белка, и если буфер необходимо заменить, осторожно добавьте новый буфер (ультрафильтрация через ультрафильтрационную мембрану 0,22 мкм) примерно до 1 мл общего белка и повторно концентрируйте примерно до 1 мл в течение трех несколько раз подряд, при этом конечный концентрированный объем зависит от желаемой концентрации белка, обычно не более 500 мкл, но также и в пределах 200 мкл.Достигните 1000-кратного или более увеличения в трех случаях, по существу, такого же изменения буфера, которое рассчитано как минимум в 10-кратном или около того объемном обогащении каждый раз.
Время публикации: 9 ноября 2022 г.