ПЦР, представляет собой полимеразную цепную реакцию, которая относится к добавлению dNTP, Mg2+, факторов элонгации и факторов усиления амплификации к системе под катализом ДНК-полимеразы с использованием родительской ДНК в качестве матрицы и специфических праймеров в качестве начальной точки удлинения, Посредством стадий денатурации, отжига, удлинения и т. д. процесс репликации in vitro ДНК дочерней цепи, комплементарной матричной ДНК родительской цепи, может быстро и специфично амплифицировать любую целевую ДНК in vitro.
1. ПЦР с горячим стартом
Время начала амплификации в обычной ПЦР заключается в том, чтобы не помещать машину ПЦР в машину ПЦР, а затем программа начинает амплифицировать.Когда настройка системы завершена, начинается амплификация, которая может привести к неспецифической амплификации, и ПЦР с горячим стартом может решить эту проблему.
Что такое ПЦР с горячим стартом?После подготовки реакционной системы модификатор фермента высвобождается при высокой температуре (обычно выше 90°C) во время начальной стадии нагревания реакции или стадии «горячего старта», так что ДНК-полимераза активируется.Точное время и температура активации зависят от природы ДНК-полимеразы и модификатора горячего старта.В этом методе в основном используются модификаторы, такие как антитела, аффинные лиганды или химические модификаторы, для ингибирования активности ДНК-полимеразы.Поскольку активность ДНК-полимеразы ингибируется при комнатной температуре, технология горячего старта обеспечивает большое удобство для приготовления нескольких реакционных систем ПЦР при комнатной температуре без ущерба для специфичности реакций ПЦР.
2. ОТ-ПЦР
ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) — это экспериментальный метод обратной транскрипции мРНК в кДНК и использования ее в качестве матрицы для амплификации.Экспериментальная процедура заключается в том, чтобы сначала извлечь тотальную РНК из тканей или клеток, использовать Oligo (dT) в качестве праймера, использовать обратную транскриптазу для синтеза кДНК, а затем использовать кДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации для получения целевого гена или обнаружения экспрессии гена.
3. Флуоресцентная количественная ПЦР
Флуоресцентная количественная ПЦР (Количественная ПЦР в реальном времени,ОТ-кПЦР) относится к методу добавления флуоресцентных групп в реакционную систему ПЦР с использованием накопления флуоресцентных сигналов для мониторинга всего процесса ПЦР в реальном времени и, наконец, с использованием стандартной кривой для количественного анализа матрицы.Обычно используемые методы qPCR включают SYBR Green I и TaqMan.
4. Вложенная ПЦР
Вложенная ПЦР означает использование двух наборов праймеров ПЦР для двух раундов амплификации ПЦР, а продуктом амплификации второго раунда является фрагмент целевого гена.
Если несоответствие первой пары праймеров (внешних праймеров) приводит к амплификации неспецифического продукта, вероятность того, что та же неспецифическая область будет распознана второй парой праймеров и продолжит амплификацию, очень мала, поэтому амплификация второй парой праймеров улучшила специфичность ПЦР.Одним из преимуществ проведения двух раундов ПЦР является то, что это помогает амплифицировать достаточное количество продукта из ограниченного количества исходной ДНК.
5. ПЦР приземления
Тачдаун-ПЦР — это метод повышения специфичности реакции ПЦР путем корректировки параметров цикла ПЦР.
При тачдаун-ПЦР температура отжига для первых нескольких циклов устанавливается на несколько градусов выше максимальной температуры отжига (Tm) праймеров.Более высокая температура отжига может эффективно снизить неспецифическую амплификацию, но в то же время более высокая температура отжига усугубит разделение праймеров и целевых последовательностей, что приведет к снижению выхода ПЦР.Поэтому в первых нескольких циклах температуру отжига обычно устанавливают пониженной на 1°C за цикл, чтобы увеличить содержание целевого гена в системе.Когда температура отжига снижается до оптимальной, температура отжига сохраняется в течение оставшихся циклов.
6. Прямая ПЦР
Прямая ПЦР означает амплификацию целевой ДНК непосредственно из образца без необходимости выделения и очистки нуклеиновой кислоты.
Существует два типа прямой ПЦР:
прямой метод: возьмите небольшое количество образца и добавьте его непосредственно в PCR Master Mix для ПЦР-идентификации;
метод крекинга: после отбора пробы добавить ее в лизат, лизировать для высвобождения генома, взять небольшое количество лизированного супернатанта и добавить его в PCR Master Mix, провести ПЦР-идентификацию.Этот подход упрощает экспериментальный рабочий процесс, сокращает время практической работы и позволяет избежать потери ДНК на этапах очистки.
7. СОЭ ПЦР
При сплайсинге генов методом ПЦР с удлинением перекрытия (SOE PCR) используются праймеры с комплементарными концами, чтобы продукты ПЦР образовывали перекрывающиеся цепи, так что в последующей реакции амплификации за счет удлинения перекрывающихся цепей используются разные источники метода, при котором амплифицированные фрагменты перекрываются. и сращены между собой.В настоящее время эта технология имеет два основных направления применения: создание слитых генов;сайт-направленная мутация гена.
8. МПКР
Обратная ПЦР (IPCR) использует обратные комплементарные праймеры для амплификации фрагментов ДНК, отличных от двух праймеров, и амплифицирует неизвестные последовательности с обеих сторон известного фрагмента ДНК.
IPCR изначально был разработан для определения последовательности соседних неизвестных областей и в основном используется для изучения последовательностей промоторов генов;онкогенные хромосомные перестройки, такие как слияние генов, транслокация и транспозиция;и интеграция вирусных генов также широко используются в настоящее время. Для сайт-направленного мутагенеза скопируйте плазмиду с желаемой мутацией.
9. дПЦР
Цифровая ПЦР (дПЦР) — это метод абсолютного количественного определения молекул нуклеиновой кислоты.
В настоящее время существует три метода количественного определения молекул нуклеиновой кислоты.Фотометрия основана на поглощении молекул нуклеиновых кислот;флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР в реальном времени) основана на значении Ct, а значение Ct относится к номеру цикла, соответствующему значению флуоресценции, которое можно обнаружить;цифровая ПЦР — это новейшая количественная технология, основанная на методе ПЦР одиночных молекул для подсчета количества нуклеиновых кислот. Это абсолютный количественный метод.
Время публикации: 13 июня 2023 г.